Microscopia multimodale per l’imaging dei tessuti biologici
La microscopia a scansione laser offre soluzioni promettenti per l’imaging dei tessuti a livello sub-cellulare e può fornire sia informazioni morfologiche che funzionali in una modalità priva di marcatori esogeni. La combinazione di tecniche di microscopia ottica non-lineare (NLO) che forniscono informazioni morfologiche con quelle che forniscono informazioni funzionali è una questione cruciale per la classificazione e valutazione dei tessuti patologici. Infatti, una caratteristica importante per studiare lo sviluppo di una patologia del tessuto è capire il rapporto tra le caratteristiche morfologiche quali architettura, forma, simmetria, e la funzionalità del tessuto stesso. La corretta combinazione di tecniche di microscopia NLO con tecniche Raman in un approccio di imaging multimodale morfo-chimico può classificare i tessuti in modo veloce, affidabile, e senza marcatori esogeni. L’esperimento si propone di sviluppare due diverse piattaforme di microscopia a scansione laser avanzata. Una prima piattaforma che combini tecniche di microscopia non lineari (fluorescenza a due fotoni, generazione di seconda armonica, imaging di vita media di fluorescenza) con la microspettroscopia Raman permetterà di realizzare uno strumento in grado di fornire una caratterizzazione morfo-funzionale dei campioni esaminati. Una seconda piattaforma che combini la microscopia in fluorescenza a due fotoni e la microscopia in seconda armonica con la microspettroscopia Brillouin consentirà di studiare la morfo-meccanica dei tessuti, analizzando sia la morfologia che la biomeccanica per mezzo di un approccio correlativo interamente ottico, non invasivo e non a contatto. Gli strumenti saranno poi utilizzati in varie attività di ricerca, come:
– Applicazione della microscopia laser non-lineare alla patologia digitale
La crescente necessità di una diagnosi più accurata, obiettiva e più veloce ha spinto i ricercatori a unire l’imaging digitale con la diagnostica di routine. Il termine “Patologia Digitale” si riferisce alla pratica clinica focalizzata sull’uso della tecnologia ottica ed informatica per lo sviluppo di immagini ad alta risoluzione, a partire da vetrini contenenti campioni di tessuto. Anche se la “Patologia Digitale” sta trasformando le procedure diagnostiche, questa si applica soltanto a vetrini con colorazione H&E e dunque consente la semplice classificazione morfologica dei tessuti. Gli aspetti funzionali richiedono procedure di immunoistochimica per essere messi in evidenza. La microscopia ottica non-lineare (NLO) offre soluzioni promettenti per l’imaging dei tessuti a livello sub-cellulare e può fornire sia informazioni morfologiche che funzionali in una modalità priva di marcatori esogeni. In questo esperimento ci proponiamo di combinare i vantaggi offerti dalla “Patologia Digitale” con le potenzialità offerte dalla microscopia NLO per l’analisi e la diagnostica di campioni biologici di tessuto umano in maniera rapida, obiettiva e affidabile. L’approccio verrà utilizzato a fini diagnostici sia per le patologie tumorali che per quelle non tumorali.
– Imaging morfo-meccanico della cornea
L’esperimento è mirato all’utilizzo di un approccio di imaging correlativo che combini la microscopia SHG con la microspettroscopia a Brillouin, finalizzato allo studio della morfomeccanica tissutale, con particolare attenzione all’imaging della cornea. In particolare, la microscopia a generazione di seconda armonica (SHG) verrà implementata sia con rivelazione in avanti che in epi-rivelazione, in combinazione con uno schema di eccitazione a scansione di polarizzazione. L’obiettivo principale è quello di sfruttare il forte segnale SHG emesso dal collagene per caratterizzare la sua organizzazione in campioni di cornea sani e patologici. La caratterizzazione morfologica del campione, fornita dalla microscopia SHG, sarà correlata con le corrispondenti proprietà viscoelastiche, messe in evidenza dalla microspettroscopia Brillouin. Questa attività è finalizzata all’avanzamento tecnico-scientifico nel campo dell’imaging diagnostico oftalmico, mediante lo sviluppo di nuove tecniche all’avanguardia, le loro applicazioni a patologie specifiche e la loro possibile integrazione in un’unica piattaforma, utile per la diagnostica oftalmica clinica. Inoltre, l’integrazione sinergica della microscopia Brillouin e SHG fornirà una caratterizzazione senza precedenti delle caratteristiche morfo-meccaniche dei campioni di tessuto ricchi di collagene, aprendo una nuova frontiera nell’imaging biologico e biomedico, creando un grosso impatto in tutte le procedure cliniche che richiedono una valutazione non invasiva della morfologia del collagene e della biomeccanica corrispondente.
Immagini SHG (sulla sinistra) e mappe della variazione relativa della frequenza Brillouin (sulla destra), acquisite in profondità nello stroma corneale sotto la membrana di Bowman. Barre di scala: 10 um.